جداسازی و کلون کردن hbeag و ساخت سوش بیانی pichia pastoris برای این آنتی ژن

در این پژوهش ژن hbeag از ژنوم کامل hbv سویه ayw با روش pcr جداسازی شد. محصول pcr پس از تخلیص و آنالیز با آنزیم های محدودکننده و انجام مراحل کلونینگ در وکتور puc18 جهت بررسی نهایی به وسیله واکنش های ترادف یابی(sequancing) با تکنیک alf مورد تایید قرار گرفت . در مرحله بعد ژن e آنتی ژن در وکتورهای بیانی phild2 و phils1 که وکتورهای دوسو(shuttle) برای مخمر pichia pastoris و باکتری e.coli می باشند، تحت پروموترaox1، کلون گردید. آنالیزهای آنزیمی صحت ساختار پلاسمید نوترکیب را از لحاظ جهت قرارگیری ژن و ترادف اجزاء واحد بیانی، مورد تایید قرار داد. پلاسمیدهای نوترکیب phild2e و phils1e به صورت خطی (linearized) جهت ترانسفرم کردن p.pastoris با 4 روش ترانسفورماسیون لیتیوم کلراید، 1000 peg ، الکتروپوراسیون و اسفروپلاست بکار رفتند. غربال کلنی های ترانسفرم شده بر روی محیط حداقل، مشاهدات میکروسکوپی، استخراج ژنوم مخمرهای نوترکیب و انجام آنالیز pcr ، ساخت سوش بیانی pichia pastoris برای hbeag را مورد تایید قرار داد. بررسی نتایج روشهای مختلف ترانسفورماسیون نشان داد که اسفروپلاست موثرترین روش ترانسفرم کردن این مخمر می باشد.